Juan de Ayolas nació en Briviesca en el año 1510.
Formó parte de la expedición de Pedro de Mendoza que partió del puerto de Sanlucar de Barrameda en el año de 1535. Con el título de Mayordomo del Adelantado Don Pedro de Mendoza y alguacil mayor de la armada asistió a la fundación de Nuestra Señora del Buen Ayre (Buenos Aires) en el año de 1536.
Ante la escasez de provisiones y la hostilidad de los indios, que amenazaban la supervivencia de la ciudad, Ayolas emprendió una expedición en la que remontó el curso del Paraná con la intención de establecer una vía de comunicación con el Perú y conseguir víveres.En su marcha fue interceptado por los caciques guaraníes Lambaré y Yanduvazuví Rubichá a los que venció en batalla. A raíz de esta situación se celebró una capitulación el 15 de agosto de 1536 en la que los guaraníes se aliaron a los españoles reconociendo la autoridad de éstos. Ayolas levantó el fuerte de Corpus Christi, adonde se trasladaron Mendoza y el grueso de la guarnición desde la insegura Santa María del Buen Aire.
Incitado por los rumores sobre la existencia de enormes riquezas en las tierras del oeste, Ayolas partió en busca de la mítica sierra de la Plata y exploró el curso del Paraná, en cuyas orillas fundó el fuerte de Candelaria, el 2 de febrero de 1537 (hacia los 19° de latitud sur según algunas fuentes -por lo cual estaría prácticamente donde hoy se halla Corumbá, hacia los 21°S según otras fuentes -por lo cual habría estado en tal caso algo al norte de Fuerte Olimpo, cerca de la desembocadura del río Blanco en el río Paraguay-), donde dejó como lugarteniente a Domingo Martínez de Irala.
Pedro de Mendoza, en virtud de sus facultades, lo designa su sucesor como gobernador del Río de la Plata. El 22 de abril de 1537, Pedro de Mendoza al no estar presente Ayolas para la transmisión del mando, lo delegó provisoriamente en Francisco Ruiz Galán.
Continuando con la búsqueda de una comunicación con el Perú, Ayolas continuó con su empresa hasta llegar a la actual Bolivia y cruzar por primera vez la región del Chaco.
Tras ese periplo regresa al fuerte de la Candelaria que encuentra abandonado. Allí falleció tras un ataque de los indígenas.
Su sucesor como gobernador de Río de la Plata fue Domingo Martínez de Irala.
Juan de Ayolas junto con Alejo Gracía fueron los primeros hombres blancos en tomar contacto con los indios Cararás. De regreso de una de aquellas expediciones sufrieron una emboscada de los indios Payaguas en las orillas del río Paraguay en 1537, muriendoJuan de Ayolas. De aquel viaje solo se salvó un hombre llamado Rodrigo de Cepeda que tras unas largas jornadas a través de la selva llegó a Perú para informar a Pedro de Mendoza del infortunio.
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